Nach der Machtübergabe an die Nationalsozialisten verschlechtern sich die Haftbedingungen, die Zahl
der politischen Häftlinge steigt rasant an. Die amtierende Gefängnisdirektorin, SPD-Mitglied Rosa
Helfer, wird bereits im März 1933 entlassen.
Erst nach und nach, insbesondere zwischen 1941 und 1943, werden in die leitenden Funktionen des
Hauses NSDAP-Anhängerinnen eingesetzt.
Ab Februar 1933 werden die Bürgerrechte der Weimarer Republik außer Kraft gesetzt. Vom
Willkür-Instrument der "Schutzhaft" wird nun verstärkt Gebrauch gemacht und zahlreiche Frauen
aus der Arbeiterbewegung inhaftiert. Später sind auch viele Anhängerinnen der Zeugen Jehovas
unter den politischen Häftlingen.
Bis Ende der 1930er Jahre finden regelmäßig Transporte von der Barnimstraße in die
Konzentrationslager Moringen und Ravensbrück statt, später sind ausschließlich die Konzentrationslager
für "Schutzhaftgefangene" zuständig.
Die unverhältnismäßigen Bestrafungen durch einige Aufseherinnen nehmen die inhaftierten Frauen nicht widerspruchslos hin. Mit einem Streik können sie 1935 noch die Auswechslung einer Aufseherin erreichen. Gegen die schlechte Versorgung protestieren sie im Sommer 1937 mit dem Ruf "Hunger". Allerdings werden solche Aktionen häufig mit Haftverschärfung bestraft. Unter den Aufseherinnen gibt es aber auch einige, die mit Verständnis und vorsichtiger Hilfe die inhaftierten Frauen ihre Sympathie spüren lassen.
"Die Barnimstraße", wie das Gefängnis umgangssprachlich genannt wird, ist sowohl Untersuchungs- wie auch Strafhaftanstalt. Für Verhöre und oft Folterungen durch die Gestapo werden die Gefangenen abgeholt und meist in das Polizeipräsidium Alexanderplatz (Sitz der Gestapo) oder in das Hauptquartier der Gestapo in der Prinz-Albrecht-Straße gebracht. Anschließend kehren die Frauen in die Barnimstraße zurück.
Ab 1940 wird der Arbeitseinsatz der Häftlinge vollständig auf kriegs- und wehrwichtige Aufgaben umgestellt. Das Frauengefängnis übernimmt Arbeitsaufträge für die Wehrmacht, Rüstungsfirmen richten Werkbetriebe in der Barnimstraße ein oder fordern Außenkommandos an. Frauen, die dazu körperlich nicht in der Lage sind, müssen stattdessen u.a. Strümpfe für Wehrmachtssoldaten stricken.
Für über 300 Frauen wird das Frauengefängnis Barnimstraße zu einer Zwischenstation auf dem Weg zur Hinrichtungsstätte Plötzensee.